Vývoj real-time PCR systému pro diagnostiku fytoplazem napadajících rostliny rodu Vaccinium

Čmejla R.¹*, Valentová L.¹, Rejlová M.¹

¹VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o., *radek.cmejla@vsuo.cz

Úvod

Borůvky a brusinky patři mezi oblíbené drobné ovoce, které roste na botanickém rodu brusnice (Vaccinium). Nejznámější z těchto druhů je brusnice chocholičnatá známá jako „kanadská borůvka“ (Vaccinium corymbosum L.), jejíž pěstování je stále populárnější jak mezi pěstiteli, tak zahrádkáři. Pro dlouhodobě udržitelnou produkci je nezbytné pracovat se zdravým vstupním materiálem, který je nutné testovat na legislativně vymezené patogeny (viry, bakterie, houby) a škůdce. Významnou skupinu z hlediska hospodářských škod představují fytoplazmy (Candidatus Phytoplasma), bakterie, které jsou obligátními intracelulárními parazity vodivých pletiv. U rodu brusnice se povinně testují čtyři druhy:Candidatus Phytoplasma asteris, která způsobují zakrslost brusnice (blueberry stunt disease); Candidatus Phytoplasma pruni, která způsobují metlovitost u rodu Vaccinium; cranberry false blossom phytoplasma, která způsobuje nepravé kvetení u brusnice brusinky; a Candidatus Phytoplasma solani, která způsobují onemocnění stolbur. Pro tyto fytoplazmy neexistuje jednotná a citlivá metodika jejich detekce v rostlinném materiálu.

Cíl

Cílem práce bylo vyvinout detekční systém využívající metodu real-time PCR pro citlivou a spolehlivou diagnostiku Candidatus Phytoplasma asteris, Candidatus Phytoplasma pruni, cranberry false blossom phytoplasma a Candidatus Phytoplasma solani.

Materiál a metody

V databázi GenBank byly identifikovány sekvence oblasti 16S rRNA pro studované fytoplazmy a na základě fylogenetické analýzy byly identifikovány vhodné druhově-specifické oblasti pro návrh primerů a sond pro real-time PCR detekci. Specificita navržených systémů byla testována pomocí syntetických standardů, které odpovídaly cílovým sekvencím pro jednotlivé druhy fytoplazem. Pro stanovení analytické senzitivity byly standardy naředěny až na koncentraci, která odpovídala 5 kopií cíle v PCR. Pro real-time PCR byl použit Luna Universal Probe qPCR Master Mix (New England Biolabs) s běžnými koncentracemi primerů a sond. PCR proběhla v cykleru Rotor-Gene Q (Qiagen) podle teplotního profilu: 95 °C/5 minut; 40 cyklů s kroky 95 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s. Vyvinuté PCR byly ověřeny na DNA izolátech příslušných fytoplazem, které byly získány z kolekce fytoplazem spravované International Phytoplasmologist Working Group.

Výsledky

Pro návrh specifických primerů a sond bylo celkem získáno 638 sekvencí oblasti 16S rRNA příslušných fytoplazem. Specificita navrhnutých detekčních systémů byla testována pomocí syntetických standardů 50 milionů kopií v PCR. Testování pomocí těchto standardů potvrdilo 100% specificitu a analytickou senzitivitu u všech systémů na úrovni 50 kopií v reakci (Obrázek 1). Vyvinuté real-time PCR systémy jsou vhodné pro rutinní diagnostiku Candidatus Phytoplasma asteris, Candidatus Phytoplasma pruni, cranberry false blossom phytoplasma a Candidatus Phytoplasma solani u rostlin rodu brusnice (Vaccinium).

Poděkování

Práce byla podpořena výzkumným projektem Národní agentury pro zemědělský výzkum (NAZV) Ministerstva zemědělství České republiky č. QL24020033.

Obrázek 1A.

Obrázek 1B.

Obrázek 1C.

Obrázek 1D.

Obrázek 1A-D. Příklad stanovení senzitivity real-time PCR detekce pro jednotlivé druhy fytoplazem pomocí syntetického standardu. Počet kopií v reakci: 100 000 (1 vzorek), 50 000 (1 vzorek), 5 000 (1 vzorek), 500 (4 vzorky), 50 (4 vzorky) a 5 (4 vzorky). A) Candidatus Phytoplasma asteris; B) Candidatus Phytoplasma pruni; C) cranberry false blossom phytoplasma; D) Candidatus Phytoplasma solani