Vývoj multiplexní real-time PCR soupravy pro komplexní diagnostiku virů a fytoplazem infikujících rostliny rodu Vaccinium

Čmejla R.¹*, Valentová L.¹, Rejlová M.¹

¹VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.

^*radek.cmejla@vsuo.cz

Úvod

Brusnice chocholičnatá (Vaccinium corymbosum L.), známá jako kanadská borůvka, je nejpěstovanějším druhem z rodu Vaccinium (Obrázek 1). Vzhledem k dlouhověkosti těchto rostlin je pro úspěšné pěstování nezbytné použít zdravý výchozí rozmnožovací materiál. Dle platné české legislativy se povinně sleduje přítomnost sedmi virů a čtyř fytoplazem: blueberry mosaic associated virus (BlMaV), blueberry scorch virus (BlScV), blueberry shoestring virus (BSSV), blueberry red ringspot virus (BRRV), blueberry shock virus (BlShV), tomato ringspot virus (ToRSV) a tobacco ringspot virus (TRSV); Candidatus Phytoplasma asteris, Candidatus Phytoplasma pruni, cranberry false blossom phytoplasma a Candidatus Phytoplasma solani.

Obrázek 1. Výsadba brusnice chocholičnaté („kanadská borůvka“; Vaccinium corymbosum L.)

 Cíl

Cílem práce bylo vyvinout diagnostickou soupravu založenou na multiplexní real-time PCR, která by umožnila detekovat všechny patogeny v co nejmenším množství reakcí. Metoda detekce by navíc měla být validována, aby mohla být použita pro rutinní testování i v akreditovaných laboratořích.

Materiál a metody

Návrh a ověření qPCR systému pro detekci jednotlivých patogenů byl obdobný a probíhal v několika krocích: i) získání a porovnání sekvencí dostupných izolátů z databáze GenBank, analýza sekvencí a identifikace vhodné oblasti pro návrh primerů a sond; ii) ověření funkčnosti pomocí syntetických standardů a reálných izolátů, ověření potenciální křížové reaktivity s transkriptomem hostitelských druhů; iii) provedení multiplexování, ověření funkčnosti a výkonnosti ve srovnání se simplexovým systémem; iv) validace – stanovení výkonnostních parametrů testu – specificita, analytická senzitivita, opakovatelnost a reprodukovatelnost. Testování probíhalo s využitím cykleru Rotor-Gene Q (Qiagen) a Luna Universal Probe qPCR Master Mix (New England Biolabs) s běžnými koncentracemi primerů a sond. Simplexní i multiplexní qPCR systémy byly ověřeny pomocí syntetických standardů typu ultramer (Integrated DNA Technologies) a na reálných izolátech virů a fytoplazem.

Výsledky

Na základě provedených analýz dostupných sekvencí byly pro jednotlivé patogeny identifikovány vhodné cílové oblasti pro návrh primerů a sond. Jako interní pozitivní kontrola (IPC) byl vybrán gen pro mitochondriální gen Nad5 pro kontrolu kvality izolace RNA a následné přípravy cDNA a současně k ověření případných inhibitorů PCR. Pro kontrolu kvality izolované DNA byl použit gen pro chloroplastovou 16S rRNA; tuto kontrolu lze však použít i pro kontrolu kvality RNA/cDNA, protože transkript je v rostlinných buňkách hojně exprimován. Dle výsledků testování byly patogeny rozděleny do tří detekčních sad (Tabulka 1), které byly označeny jako BluebVir I a BluebVir II pro detekci všech sedmi virů včetně IPC pro kontrolu kvality RNA/cDNA, a sada PhytoBlueb, kterou lze detekovat všechny čtyři fytoplazmy včetně IPC pro kontrolu kvality DNA/RNA/cDNA.

Tabulka 1. Rozdělení testovaných patogenů do příslušných diagnostických sad a použité značení sond pro jejich současnou detekci metodou multiplexní real-time PCR.

Výsledky ukázaly, že navržené multiplexní detekční sady jsou specifické pro daný cílový patogen/IPC; limit detekce byl pro jednotlivé patogeny ≤ 500 kopií/reakci; pro všechny testované patogeny byla opakovatelnost < 2,3 % a reprodukovatelnost < 3,4 % pro dané ředění (měřeno jako variační koeficient). Vyvinutou diagnostickou soupravu lze považovat za validovanou a použitelnou pro akreditované laboratoře.

Poděkování

Práce byla podpořena výzkumným projektem Národní agentury pro zemědělský výzkum (NAZV) Ministerstva zemědělství České republiky č. QL24020033.