Vliv vybraných kmenů prospěšných bakterií na Dickeya solani způsobující měkkou hnilobu hlíz bramboru v podmínkách in vivo

Kmoch M.¹, Loubová V.¹, Demnerová K.², Sýkorová H.², Jílková B.³

¹Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o., ²Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, ³Mendelova univerzita v Brně

Úvod

Pektinolytické bakterie rodu Pectobacterium a Dickeya jsou fytopatogeny zodpovědné za několik chorob u široké škály plodin a okrasných rostlin (Pérombelon, 1992; Toth et al., 2011). Škody způsobené těmito patogeny zůstávají v mnoha zemích světa důležitým problémem. Způsobují měkkou hnilobu hlíz a bakteriální černání stonku bramboru (tzv. černou nohu) (Golanowska & Łojkowska, 2016; Pérombelon, 2002). Mohou být příčinou značných ekonomických ztrát díky snižování kvality konzumních hlíz a vyřazování brambor během certifikace sadby (Tóth et al., 2011). Ochrana bramboru před pektinolytickými bakteriemi je obtížná kvůli nedostatku rezistence u komerčních odrůd bramboru a absenci účinných látek (Czajkowski et al., 2011). Biologická ochrana založená na použití antagonistických mikroorganismů je potenciálně slibnou alternativou nebo doplňkem integrované ochrany bramboru, která může významně snížit negativní dopad pesticidů na životní prostředí (Lodewyckx et al., 2002; Lahlali et al., 2022).

Cílem experimentů bylo zjištění účinnosti vybraných užitečných antagonistických bakterií z rodu Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Rhodococcus a Lactiplantibacillus na patogenní bakterii Dickeya solani, původce měkké hniloby hlíz a černání stonků bramboru, pomocí in vivo experimentů na plátcích hlíz bramboru. Problematika je důležitá mimo jiné pro vývoj nových biopesticidů využitelných v biologické ochraně bramboru před pektinolytickými bakteriemi.

Materiál a metody

Pro experimenty byly vybrány kmeny prospěšných bakterií z České sbírky mikroorganismů (Masarykova univerzita, Brno) s potenciální antimikrobiální aktivitou uvedené v Tab. 1. Patogenní bakterie D. solani (kmen CPPB-050 vykazující významnou pektinolytickou aktivitu) pocházela ze Sbírky fytopatogenních a zemědělsky prospěšných bakterií (CARC v.v.i., Praha) a byla izolována z lenticel odrůdy bramboru 'Laura' (Českomoravská vrchovina, Česká republika).

Pro zjištění účinnosti vybraných prospěšných kmenů bakterií na patogen D. solani byly použity in vivo testy na plátcích hlíz bramboru. Zdravé hlízy odrůdy 'Red Anna' (česká odrůda citlivá na infekci pektinolytickými bakteriemi) byly omyty pod tekoucí vodou pro odstranění ulpívajících zbytků půdy, dezinfikovány v 1% roztoku NaClO (Unilever, Bohumín, Česká republika) po dobu 15 min, následně opláchnuty ve sterilní vodě a osušeny na vzduchu při pokojové teplotě přes noc.

Kmeny bakterií byly uchovávány ve 45% glycerolu v hlubokomrazicím boxu (- 80 °C). Bakterie byly před testy naneseny na Petriho misky (90 mm) s King’s Medium B Base (HiMedia, Mumbai, India) a inkubovány po dobu 48 hodin při teplotě 22 ± 1 °C. Bakterie byly poté z těchto ploten seškrábnuty a suspendovány sterilní destilovanou vodou na koncentraci 1,5 × 10⁸ CFU/ml. Koncentrace bakterií v roztoku byla zkontrolována pomocí McFarland denzitometru DEN-1 Photometer (Biosan, Latvia, Riga). Antagonistická aktivita prospěšných bakterií byla zjištěna dle upravené metody Hadizadeh et al. (2019). Dezinfikované hlízy brambor nakrájeny na plátky 10 mm silné. Do středu plátků hlíz byly vytvořeny jamky (průměr 6 mm, hluboké 3 mm) pomocí sterilního korkovrtu a skalpelu. Plátky hlíz byly vyrovnány do sterilních uzavíratelných boxů z PVC o objemu 25 l na filtrační papír nasycený 150 ml destilované vody. Na jednu variantu pokusu bylo použito 21 plátků brambor z 21 různých hlíz. Do jamek plátků hlíz bylo nejprve pomocí pipety naneseno 15 μl suspenze prospěšného kmenu bakterie o koncentraci 1,5 × 10⁸ CFU/ml. Plátky byly ponechány po dobu 2 h při teplotě 22 ± 1 °C °C, aby roztok bakterií mohl dobře difundovat do pletiv. Do jamek plátků hlíz byla potom nanesena bakteriální suspenze D. solani (15 μl) o koncentraci 1,5 × 10⁸ CFU/ml. Jako pozitivní kontrola sloužila varianta bez ošetření plátků hlíz prospěšnými kmeny bakterií (pouze inokulace suspenzí pektinolytické bakterie D. solani,kmen CPPB-050). Jako negativní kontroly byly použity varianty s aplikací roztoku prospěšných bakterií a sterilní destilované vody. Od každé varianty pokusu byla provedena tři opakování pro statistické vyhodnocení. Potom byly boxy uzavřeny a uloženy při teplotě 22 ± 1 °C do tmy. Po pěti dnech inkubace bylo provedeno vyhodnocení pokusu. Pro tento účel byly plátky hlíz na jednotlivých variantách pokusu vyfotografovány fotoaparátem Olympus TG-6 (Olympus, Tokyo, Japan) a následně bylo provedeno vyhodnocení rozsahu infekce hlíz (plocha macerace v mm²) pomocí softwaru ImageJ 1.53e (Maryland, USA, https://imagej.net/software/imagej/) a byla vypočítána účinnost bioagens na D. solani porovnáním s pozitivní kontrolou.

Statistické vyhodnocení experimentů bylo provedeno pomocí analýzy rozptylu (jednofaktorová ANOVA) a Tukey-HSD testu (α = 0,01; program STATISTICA 7, StatSoft, Inc., USA), kde byla porovnána účinnost prospěšných kmenů bakterií na D. solani.

Výsledky

Pomocí in vivo experimentů na plátcích hlíz bramboru byla zjištěna účinnost vybraných bakteriálních kmenů na růst patogenu Dickeya solani, původce měkké hniloby hlíz a černání stonků bramboru. U všech testovaných kmenů bakterií byla zjištěna antagonistická aktivita na D. solani. Mezi kmeny bakterií byly ale zjištěny významné rozdíly v účinnosti na patogen D. solani (obr. 1 a 2), která se pohybovala v rozmezí 1,92-87,08 %. Nejvyšší účinnost byla prokázána u Pseudomonas fluorescens (CCM 4795 a CCM 7140) a Serratia plymuthica (CCM 3417). Účinnost u těchto kmenů se pohybovala mezi 61,08-87,08 %.

Obrázek 1. Porovnání účinnosti kmenů prospěšných bakterií na patogen D. solani na plátcích hlíz

Vybrané kmeny prospěšných bakterií mají potenciál pro využití v biologické ochraně bramboru před patogenem D. solani. Účinnost bakterií je nutné ještě ověřit pomocí experimentů během skladování hlíz a ve skleníkových a následně polních pokusech.

Obrázek 2. Průměrná účinnost prospěšných kmenů bakterií na patogen D. solani

Poděkování

Příspěvek byl zpracován s podporou Ministerstva zemědělství ČR – projekt NAZV
č. QL24010148 „Alternativní způsoby biologické ochrany bramboru za využití bioagens a látek přírodního původu“.

Poděkování patří pracovníkům České sbírky mikroorganismů (CCM; Masarykova univerzita) a Sbírce fytopatogenních a zemědělsky prospěšných bakterií (CPABB; CARC – Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i.) za poskytnutí potřebných bakteriálních kmenů. Obě sbírky patří pod Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů mikroorganismů a drobných živočichů hospodářského významu (NPGZM).

Kontaktní adresa

Ing. Martin Kmoch, Ph.D.

Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.

Dobrovského 2366, 580 01 Havlíčkův Brod

569 466 231, kmoch@vubhb.cz