Vliv kombinace růstových regulátorů na indukci kalusu a regenerační kompetenci listových explantátů třešně (Prunus avium L.)

Burešová M.¹, Čmejla R.¹

¹Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o.

Úvod

Kalus představuje heterogenní populaci buněk, které se liší stupněm diferenciace, proliferační aktivitou a regenerační kompetencí. Může mít různé morfologické a vývojové charakteristiky, přičemž intenzita jeho proliferace nemusí odpovídat schopnosti následné regenerace (Ikeuchi et al., 2013; Fehér, 2019). Jeho vlastnosti ovlivňuje zejména typ a fyziologický stav explantátu, složení kultivačního média a koncentrace růstových regulátorů, především auxinů a cytokininů. Podmínky podporující růst kalusu proto nemusí současně podporovat jeho přežití a organogenezi (Ikeuchi et al., 2013). U třešně ptačí (Prunusavium L.) je regenerace invitro náročná a závisí na genotypu, typu explantátu, kultivačním médiu a použitých růstových regulátorech. Regenerace z listových explantátů i prostřednictvím organogenního kalusu byla u tohoto druhu popsána, přičemž podmínky podporující proliferaci nemusejí být optimální pro tvorbu výhonů (Tang etal., 2002; Bhagwat a Lane, 2004; Feeney etal., 2007). Optimalizace jednotlivých fází kultivace je proto zásadní pro dosažení účinné regenerace.

Cíl

Cílem této práce bylo zhodnotit vliv kombinací 6‑benzylaminopurinu (BAP) a picloramu (Pic) na růst kalusu indukovaného z listových explantátů Prunus avium L. ‘Bing’ na dvou typech bazálního média, dle Quoirina a Lepoivra (1977; QL) a Lloyda a McCowna (1981; Woody Plant Medium, WPM). Současně byla hodnocena životaschopnost kalusů po jejich přenosu na regenerační média odpovídající původnímu bazálnímu médiu.

Materiál a metody

Zdrojovým materiálem byly invitro kultivované rostliny třešně ptačí ‘Bing’, předpěstované čtyři týdny na médiu MS s 1,0 mg/l BAP a 0,1 mg/l IBA. Z listů byly připraveny explantáty, které byly umístěny adaxiální stranou dolů na kalus-indukční média s bazálními solemi QL nebo WPM. Bylo testováno 10 kombinací BAP a Pic v koncentracích 0,0‒3,0 mg/l, včetně kontroly bez růstových regulátorů. Každá kombinace zahrnovala tři biologická opakování se třemi technickými replikacemi. Explantáty byly kultivovány při 24 °C, první týden ve tmě a následně tři týdny při fotoperiodě 12/12 h a intenzitě PAR 35 µmol/m²/s. Po čtyřech týdnech byly kalusy přeneseny na regenerační média odpovídajícího bazálního složení s 1,0 mg/l BAP a 0,1 mg/l IBA. Po osmi týdnech bylo hodnoceno jejich přežití. Plocha explantátů byla stanovena z fotografií v programu ImageJ na začátku kultivace a po čtyřech týdnech. Nárůst plochy byl vypočten jako rozdíl těchto hodnot a průměr za každou kultivační misku sloužil jako biologická replikace. Statistické analýzy byly provedeny v programu R. Normalita reziduí byla ověřena Shapiro-Wilkovým testem a Q-Q grafem, homogenita rozptylů Levenovým testem. Vliv bazálního média, kombinace BAP × Pic a jejich interakce na nárůst plochy kalusu byl hodnocen dvoufaktorovou ANOVA. Následně byly jednotlivé kombinace porovnány s kontrolou (BAP0_Pic0) pomocí Dunnettova testu samostatně pro každé médium.

Výsledky

Dvoufaktorová ANOVA prokázala významný vliv bazálního média a kombinace BAP × Pic na nárůst plochy kalusu (p < 0,001) a jejich vzájemnou interakci (p < 0,05). Na médiu QL byl nárůst kalusu obecně nižší a žádná z variant se statisticky významně nelišila od kontroly BAP0_Pic0 (viz Obrázek 1). Nejvyšší medián byl zaznamenán u BAP1_Pic1, avšak s výraznou variabilitou mezi replikáty. Na médiu WPM byl nárůst plochy obecně vyšší a u některých kombinací byly zjištěny statisticky významné rozdíly oproti kontrole. Nejvyšší medián vykázala kombinace BAP3_Pic3, vysoké hodnoty byly zaznamenány také u BAP1_Pic2, BAP1_Pic3, BAP2_Pic2 a BAP3_Pic1. Výsledky tedy ukazují výraznější proliferaci kalusu na médiu WPM než na QL.

Obrázek 1: Krabicové grafy nárůstu plochy kalusu na sledovaných kombinacích BAP  × Pic pro jednotlivá bazální média. Statisticky signifikatně odlišné kombinace (p < 0,05) od kontrolní kombinace BAP0_Pic0 jsou označeny hvězdičkou (*).

Přežití kalusů po přenosu na regenerační média bylo celkově nízké a bylo zaznamenáno pouze u některých kombinací BAP a Pic. Na médiu QL přežívaly kalusy u kombinací BAP1_Pic2 (3/6), BAP1_Pic3 (2/12) a BAP3_Pic1 (3/11). Přestože zůstaly životaschopné, vykazovaly známky nekrózy. Na médiu WPM bylo přežití zaznamenáno u BAP2_Pic1 (1/12), BAP3_Pic2 (1/15) a BAP3_Pic3 (1/9); přeživší kalusy byly zelené až bledě žluté, bez známek regenerace. Celkem přežilo 8 ze 30 kalusů na QL a 3 ze 34 na WPM.

Závěr

WPM podporovalo vyšší proliferaci kalusů třešně ‘Bing’ než médium QL, avšak jejich následné přežití na regeneračních médiích bylo nízké, což zdůrazňuje potřebu další optimalizace regeneračních podmínek.

Poděkování

Využito podpory MZe ČR č. RO1525. Poděkování Ing. Alexandře Slámové, DiS. a Mgr. Matěji Semerákovi za přípravu regeneračních médií.