Určení biovaru izolátů Rhizobium leguminosarum bv. trifolii pomocí specifické sekvence genu nodC

Dybová M.¹, Trněný O.¹, Novák V.², Staveníková J.¹

¹Zemědělský výzkum, spol. s r. o., Oddělení fyziologie a genetiky rostlin; ²Univerzita Palackého v Olomouci, Katedra buněčné biologie a genetiky

Úvod

Rhizobia jsou půdní bakterie, které fixují vzdušný dusík v symbióze s bobovitými rostlinami (Fabaceae). Biologická fixace dusíku (BNF) probíhá v kořenových hlízkách, jejichž tvorba závisí na kompatibilitě obou partnerů a na molekulárním dialogu zahrnujícím kořenové exudáty a bakteriální Nod faktory. Za vzniku hlízky bakterie v kořenech diferencují do bakteroidů, které pomocí nitrogenázy redukují vzdušný dusík na amoniak. Rostlina poskytuje bakteriím energii ve formě cukrů, zatímco od nich získává využitelnou formu dusíku. Účinné kmeny rhizobií tak mohou při nedostatku dusíku v půdě zvýšit výnos hostitelských rostlin a obohacovat půdu dusíkem.

Významným symbiotickým druhem je Rhizobium leguminosarum, který se dělí na tři biovary: viciae (vikev, hrách, hrachor, čočka a bob), trifolii (jetel) a phaseoli (fazol). Gen 16S rRNA, běžně používaný marker pro taxonomické zařazení, není pro rozlišení těchto biovarů vhodný kvůli své konzervovanosti. Alternativou je symbiotický gen nodC, jehož sekvence je specifická pro jednotlivé biovary.

Cílem práce bylo ověřit příslušnost 22 izolátů R. leguminosarum ze Sbírky symbiotických bakterií Zemědělského výzkumu, spol. s r. o. (ZVT), získaných z hlízek různých druhů jetelů, k biovaru trifolii pomocí PCR zaměřené na gen nodC.

Materiál a metody

Primery Rtrif_F (ACT TTG GCG AGG ACC GT) a Rtrif_R (GCC CAA CGC AGT TGC TG), velikost produktu 136 bp, byly navrženy v programu DECIPHER 3.6.0 na základě 1.519 sekvencí genu nodC z databáze NCBI. Fylogenetický strom byl programem Treemmer redukován na 59 reprezentativních sekvencí: 16 pro bv. trifolii, 27 pro bv. viciae, 10 pro Ensifer meliloti a 6 pro outgroup. Primery byly navrženy pomocí funkcí TileSeqs a DesignPrimers (velikost produktu 90–200 bp, optimální teplota nasedání 60 °C, minimální pokrytí cílové skupiny 70 %). Vypočtené teploty tání byly 58,9 °C (Rtrif_F) a 60,2 °C (Rtrif_R). Specifita byla následně ověřena in silico ve 186 genomech R. leguminosarum a 346 genomech necílových rodů.

Křížové reakce byly provedeny s osmi izoláty různých rhizobií (Mesorhizobium sp., Ensifer meliloti, Bradyrhizobium sp., Neorhizobium galegae, Agrobacterium sp. a jinými biovary R. leguminosarum). Pozitivní kontrolou byl kmen „jetel luční 18 Cripp-D748“ používaný k inokulaci jetele lučního na ZVT. Složení PCR reakce: 12,5 µl master mixu, 8,5 µl PCR vody, po 1 µl každého 10µM primeru a 2 µl templátové DNA získané povařením části zmrazeného izolátu v 300 µl sterilní vody. Program: 95 °C 5 min; 30× (95 °C 1 min, 53 °C 1 min, 72 °C 1 min); 72 °C 5 min. Produkty byly hodnoceny elektroforézou na 2% agarózovém gelu (70 V, 60–80 min).

U 22 izolátů R. leguminosarum, určených sekvenací 16S rRNA, byla provedena PCR za stejných podmínek jako v případě křížových reakcích. Kmen „jetel luční 18 Cripp-D748“ sloužil jako pozitivní kontrola, kmen R. leguminosarum z hlízek hrachu jako negativní kontrola. Byla použita také kontrola bez templátu (NTC) a interní kontrola amplifikace pomocí primerů Eub pro 16S rRNA (produkt 172 bp).

Výsledky

Při křížových reakcích nebyla u osmi izolátů necílových bakterií zjištěna amplifikace (Obr. 1). Pozitivní kontrola poskytla jediný produkt odpovídající očekávané velikosti 136 bp, což podpořilo specifitu primerového páru Rtrif.

Z 22 testovaných izolátů R. leguminosarum byl gen nodC typu trifolii detekován u 21 izolátů (Obr. 2). Jediným negativním izolátem byl „jetel šípovitý 3“. Testování proběhlo ve třech bězích po 5–9 izolátech s odpovídajícími pozitivními a negativními kontrolami. Interní kontrola amplifikace Eub byla pozitivní u všech 22 izolátů, včetně izolátu „jetel šípovitý 3“.

Determinace pomocí nodC a 16S rRNA poskytuje komplementární informace. Gen nodC na symbiotickém plazmidu může být přenášen mezi kmeny, a proto jeho detekce dokládá přítomnost genu nodC typu trifolii, nikoli druhovou příslušnost. Kombinace se sekvencí chromozomálního markeru 16S rRNA umožňuje přesnější charakterizaci a pomáhá vyloučit záměnu s rodem Neorhizobium, u kterého byla pomocí in silico kontroly nalezena podobnost v přepokládaných vazebných místech primerů.

Závěr

Přítomnost genu nodC typu trifolii byla potvrzena u 21 z 22 izolátů R. leguminosarum získaných z hlízek různých druhů jetelů. Důvěryhodnost výsledků podpořila in silico kontrola specifity primerů a křížové reakce, při nichž amplifikoval pouze kmen vyizolovaný z hlízek jetele lučního. Funkční kompatibilitu pozitivních izolátů s jetelem je nutné dále ověřit inokulačním experimentem s hodnocením aktivity nitrogenázy. Tato práce podporuje předpokládanou specifitu primerů vůči cílovému typu nodC. Primery byly navrženy tak (dostatečně krátký produkt, 136 bp), aby mohly být využity také pro kvantifikaci cílového biovaru pomocí kvantitativní PCR.

Poděkování

Příspěvek byl zpracován v rámci řešení projektu DKRVO, číslo MZE-RO1726, financovaného Ministerstvem zemědělství.

Obr. 1: Elektroforéza po PCR s křížovými reakcemi pro Rtrif primery. 2% agarózový gel, 70 V, 60 minut. Jamky zleva: DNA ladder 50 bp (BioSystems; 112 µg/ml); štírovník 8; tolice 1A; sója č. 4.1; 2Neorhizobium galegae*; bob B04; fazol obecný 2; jetel luční 18 Cripp-D748; hrách 4; vojtěška 5a; NTC.

Obr. 2: Příklad elektroforézy PCR testovaných izolátů, 2% agarózový gel, 70 V, 80 min. Nahoře reakce s primery Rtrif (136 bp), dole reakce s primery Eub (172 bp). Jamky zleva: DNA ladder 50 bp; jetel šípovitý 3; jetel šípovitý 4; jetel šípovitý 5; jetel šípovitý 6; jetel šípovitý 7; jetel 4N Atlantis 1; jetel 4N Atlantis 2; jetel inkarnát 1A; jetel luční 18 Cripp-D748; hrách 4; NTC.