- Štítky blogu
Postupy převodu in vitro kultur z bioreaktoru do ex vitro podmínek
Bilavčík A. 1, Bobrova O. 1,2, Tunklová B.1, Zámečník J. 1, Golosna L. 1, Faltus M. 1
1Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i.
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine NAS of Ukraine
Úvod a cíl
Převod dřevin z mikropropagačních zařízení do ex vitro podmínek představuje vzhledem k obtížné aklimatizaci in vitro množených rostlin významnou výzvu. Cílem této studie bylo posoudit metodické možnosti využití bioreaktorů, konkrétně systému dočasného zaplavení (TIS), pro přípravu rostlin na převod z in vitro kultivace do ex vitro podmínek. Pro pokusy byly použity in vitro kultury borůvky (Vaccinium corymbosum L., ‘Reka’). Pokusy se zaměřily na konstrukci a ověření funkčnosti adaptačních prvků umožňujících zakořeňování rostlin přímo v TIS bioreaktoru Plantform.
Materiál a metody
In vitro kultury Vaccinium corymbosum ‘Reka’ (Jan Holub s.r.o.) na agarovém WPM médiu (McCown & Lloyd, 1981) byly převedeny do TIS Plantform na kapalné WPM médium. Kultivace probíhala při 26 °C, 16/8 h fotoperiodě, zářivkách cool white a světelné intenzitě 40–50 μmol m⁻² s⁻¹. Multiplikační médium obsahovalo WPM s vitamíny, 30 g l⁻¹ sacharózy, 100 mg l⁻¹ Fe-EDDHA, 0,2 mg l⁻¹ 2iP a 0,2 mg l⁻¹ zeatinu; pH 5,3; u pevného média 7 g l⁻¹ agaru. TIS byl upraven pro vložení poloviny misky ViTray 126 umístěné na teflonované skelné síťce (obr. 1).
Obrázek 1. TIS bioreaktor Plantform upravený pro zakořeňovací experimenty. Místo původní kultivační misky vložena polovina sadbovací misky ViTray 126 s odstraněnými dvěma buňkami a síťka ze skelných vláken s teflonovou úpravou.
Jako substrát byly použity zátky Preforma 126 nebo kostky GRODAN GRO (~1 cm³). Do TIS bylo přidáno 500 ml kořenícího WPM média s 10 g l⁻¹ sacharózy a 0,5 mg l⁻¹ IBA, sterilizovaného 20 min při 121 °C a 0,2 MPa. Do připravených buněk byly vloženy 3–5 cm dlouhé multinodální řízky (obr. 2). Sledována byla kontaminace a kvalita rostlin.
Výsledky a diskuse
Po měsíci kultivace v TIS bioreaktorech byly rostliny vitální, bez příznaků kontaminace či fyziologického poškození (obr. 3). U obou testovaných substrátů nedocházelo k výrazné stresové reakci a rostliny vykazovaly typické červenání listů, obvyklé při zakořeňování borůvek. Byly pozorovány nové výhony a tvorba kořenů (obr. 4), morfologicky shodná s kořeny po zakořenění na agarovém médiu. Rostliny z TIS bioreaktorů splňovaly kritéria pro převod do ex vitro – svou velikostí, větvením i počtem listů odpovídaly rostlinám z agarových kultur. Použití TIS umožňuje efektivnější aklimatizaci díky řízené ventilaci, čímž lze zkrátit nebo vynechat fázi otužování. K dalším přínosům patří úspora agaru, snadná výměna média a možnost regulace živin i plynného prostředí. Nevýhodou zůstává vyšší pořizovací cena zařízení a riziko ztráty většího množství materiálu při kontaminaci.
Obrázek 2. Multinodální řízky borůvky ‘Reka’ nasazené v TIS bioreaktorech v kostkách z minerální vlny (vlevo) a sadbovacích zátkách (vpravo). Úsečka je 1 cm.
Obrázek 3. In vitro kultury borůvky ‘Reka’ nasazené v TIS bioreaktorech v kostkách z minerální vlny (vlevo) a sadbovacích zátkách (vpravo), přibližně po 1 měsíci od nasazení na kořenící médium. Úsečka je 1 cm.
Obrázek 4. Kořenící (šipka) in vitro rostlina borůvky ‘Reka’ po vyjmutí z kostky z minerální vlny přibližně po 1 měsíci od nasazení na kořenící médium. Úsečka je 1 cm.
Závěr a poděkování
Navržená metoda potvrzuje využitelnost TIS bioreaktorů pro přípravu rostlin k převodu do ex vitro podmínek, a to jak při použití kostek z minerální vlny, tak sadbovacích zátek. Metodika bude dále rozvíjena v rámci výzkumu Národního centra zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i., a využita i ve spolupráci s firmou Jan Holub s.r.o. Tato práce byla financována se státní podporou Technologické agentury ČR a Ministerstva průmyslu a obchodu ČR v rámci Programu TREND FW10010417.
