Možnosti zlepšování regenerace v in vitro kulturách řepky olejky

Klíma M.¹, Bartošová P.¹, Rosokha H.¹, Vrbovský V.², Baránek M.³

¹Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i., Praha-Ruzyně, ²OSEVA vývoj a výzkum, s.r.o.; ³Mendelova univerzita v Brně

Úvod

S významem řepky (Brassica napus L.) souvisí i její intenzivní šlechtění, v současnosti ve světě i v ČR s rutinním využitím in vitro biotechnologií, které výrazně zrychlují a zefektivňují celý šlechtitelský proces. Jedním z těchto přístupů je využití mikrosporové embryogeneze s následnou tvorbou zcela homozygotních genotypů prakticky během jedné generace.

Nanočástice (NPs) jsou mikroskopické partikule (< 100 nm), které vykazují jedinečné fyzikální a chemické vlastnosti díky své malé velikosti a zároveň velkému poměru povrchu k objemu. Jejich výhodou je mj. i jejich nižší toxicita. U nanočástic na bázi stříbra (AgNPs) byla zjištěna stimulace růstu rostlin. AgNPs lze využít i pro zefektivnění mikropropagace in vitro a zvýšení frekvence somatické embryogeneze.

Cíl

Cílem práce je uvést výsledky in vitro aplikace vybraných nanočástic na bázi mědi, selenu, stříbra nebo zinku z hlediska jejich vlivu na in vitro regeneraci v in vitro kulturách řepky olejky a výsledky srovnat s výstupy předchozích experimentů s dalšími typy nanočástic.

Materiál a metody

Do experimentů bylo zařazeno 8 materiálů ozimé řepky: 6 šlechtitelských materiálů ozimé řepky a dvě vysoce embryogenní liniové odrůdy (viz Tabulka 1). Nově byly do experimentů zařazeny tři typy nanočástic (NPs, viz Tabulka 1) na bázi prvků mědi a zinku; pro srovnání byly znovu testovány NPs na bázi stříbra a selenu, které v předchozích experimentech u některých genotypů vykazovaly stimulační účinek.

Udržování výchozích rostlin, odběr explantátů do in vitro a kultivace probíhaly podle standardní metodiky. Před třetí centrifugací byla suspenze mikrospor homogenizována a rozpipetována ve stejném poměru do šesti centrifugačních kyvet. Po třetí centrifugaci byl z kyvet odpipetován supernatant a do každé přidáno takové množství NLN média s jednotlivými koncentracemi převažujících složek NPs, aby koncentrace mikrospor odpovídala 6 × 10⁴/ml roztoku. Suspenze byly pipetovány po 5 ml do 60mm Petriho misek a umístěny do termostatu. Test vlivu NPs na frekvenci embryogeneze (embryogenní schopnost) byl proveden pro každou variantu ‘genotyp × koncentrace × typ NPs‘ ve třech časových opakováních.

Další kultivace suspenze probíhala ve tmě až do objevení prvních proembryí, viditelných pouhým okem. Poté byly kultury přeneseny do kultivační místnosti na orbitální třepačku. Jakmile největší embrya dosáhla délky 5 mm (obvykle po 20 dnech na světle), byl vyhodnocen vliv NPs na frekvenci embryogeneze a morfologické charakteristiky embryí.

Výsledky

U většiny genotypů, nanočástic a jejich koncentrací došlo ke statisticky významnému poklesu počtu regenerovaných embryí ve srovnání s kontrolní variantou již při koncentraci NPs 0,5 µg hlavní složky na ml NLN média (viz Tabulka 1).

Naopak navýšení počtu embryí oproti kontrole bylo zaznamenáno při koncentraci 0,5 µg/ml u

genotypu Cadeli a Navajo u nanočástic AgSeNP–11 (118,9 % a 116,0 %) a AgSeNP–13 (103,4 % a 127,9 %); statisticky významné toto navýšení bylo pro AgSeNP–13 u genotypu Cadeli a u genotypu Navajo u obou výše zmiňovaných NPs. Od koncentrace 1 µg převažující složky/ml média a vyšších už měly významný negativní vliv na frekvenci embryogeneze všechny použité NPs. K dalšímu výraznému poklesu embryogeneze došlo od koncentrace 3 µg/ml. Při koncentraci 12 µg/ml nebylo pozorováno dělení buněk a růst embryí u žádné z variant (viz Tabulka 1). U žádné z variant nebyl pozorován negativní vliv na morfologické charakteristiky embryí.

Tabulka 1. Embryogenní schopnost materiálů řepky ve srovnání s kontrolou v závislosti na typu a koncentraci nanočástic

Poděkování

Prezentované výsledky byly získány za finanční podpory projektu Ministerstva zemědělství České republiky, projekt MZE NAZV QK22010031