Molekulární přístupy k hodnocení genetické diverzity genetických zdrojů cibule

Jozová E.¹, Peterka V.¹, Třešničková M.¹, Čurn V.¹
¹Katedra genetiky a biotechnologií, FZT JU v Českých Budějovicích

Úvod

Cibule kuchyňská (Allium cepa L.) patří mezi celosvětově významné druhy zeleniny. Pro šlechtění nových odrůd a efektivní využívání genetických zdrojů je zásadní znalost dostupné genetické variability. Molekulární markery umožňují hodnotit variabilitu přímo na úrovni DNA, nezávisle na pěstebních podmínkách a vývojové fázi rostlin. Pro studium genetické diverzity, identifikaci genotypů a hodnocení příbuzenských vztahů lze využít mimo jiné markerové systémy SSR a ISSR.

Cíl

Cílem práce bylo optimalizovat izolaci DNA z cibule kuchyňské a ověřit využitelnost markerových systémů SSR a ISSR pro hodnocení genetické diverzity. Pozornost byla zaměřena na porovnání izolačních postupů a různých rostlinných pletiv, výběr reprodukovatelných a polymorfních markerů a u SSR také na ověření jejich přenositelnosti mezi vybranými druhy rodu Allium.

Materiál a metody

Genomová DNA byla izolována z kořínků (1), suché slupky (2), blanky dužnaté suknice (3), dužnaté suknice (4) a listů v různých fázích růstu. Porovnávána byla modifikovaná metoda CTAB-PVP, automatizovaná izolace systému MagCore a komerční kity DNeasy Plant Pro a DNeasy Plant Kit. Koncentrace a čistota DNA byly hodnoceny spektrofotometricky na základě absorbance při 230, 260 a 280 nm. Pro další experimenty byla metodou CTAB-PVP izolována DNA z 12 komerčních odrůd cibule a dalších druhů rodu Allium. Koncentrace DNA byla upravena na 100 ng·μl⁻¹. Testováno bylo osm SSR markerů a 13 ISSR primerů. Přenositelnost SSR markerů byla hodnocena u cibule kuchyňské, šalotky, česneku hlíznatého a cibule prorůstavé. PCR produkty byly separovány agarózovou gelovou elektroforézou a vizualizovány UV transiluminací.

Obr1. Části cibule využité pro izolaci DNA (autor V. Peterka, upraveno pomocí Copilot AI).

Výsledky

Nejlepších výsledků dosáhla metoda CTAB-PVP, která poskytovala nejvyšší koncentrace DNA a současně vysokou čistotu DNA. Nejvyšší koncentrace DNA, 767,8 ng·μl⁻¹, byla zaznamenána u listových vzorků, zatímco u ostatních analyzovaných pletiv se pohybovala v rozmezí 8,9–393,4 ng·μl⁻¹. Listová pletiva se ukázala jako nejvhodnější zdroj DNA a mezi mladšími a staršími listy nebyly zjištěny významné rozdíly. Izoláty získané metodou CTAB-PVP vykazovaly dostatečnou kvalitu pro následné PCR analýzy.

Tabulka 1 Porovnání extrakčních metod a jejich možnost využití

Z osmi testovaných SSR markerů byly pro další použití vybrány čtyři markery s dostatečnou reprodukovatelností a polymorfismem. Všechny vybrané markery amplifikovaly DNA cibule kuchyňské; tři současně amplifikovaly DNA šalotky a česneku hlíznatého, zatímco u cibule prorůstavé byla amplifikace pozorována u dvou markerů. Výsledky tak potvrdily rozdílnou míru přenositelnosti jednotlivých SSR markerů mezi zástupci rodu Allium.

Z 13 testovaných ISSR primerů byly vybrány čtyři markery s nejvyšší informační hodnotou, polymorfismem a reprodukovatelností. Získané ISSR profily vykazovaly výrazný polymorfismus a umožnily jednoznačně rozlišit všech 12 analyzovaných odrůd. ISSR markery poskytovaly širší spektrum polymorfních fragmentů, zatímco SSR markery umožňovaly přesnější hodnocení alelové variability a mezidruhové přenositelnosti.

Kombinace izolace DNA metodou CTAB-PVP a optimalizovaných SSR a ISSR markerů představuje vhodný přístup pro hodnocení genetické diverzity cibule. Optimalizované markery lze využít při charakterizaci genetických zdrojů, identifikaci genotypů a výběru geneticky hodnotných materiálů pro šlechtitelské programy.

Poděkování

Tato studie byla vytvořena díky podpoře projektu NAZV QL26010254. Další poděkování patří společnosti MORAVOSEED CZ a.s. za poskytnuté materiály.