Metodika detekce bakterií rodu Pectobacterium v půdě pomocí qPCR

Holková L.¹, Alba-Mejía J.E.¹, Jílková B.¹, Víchová J.¹, Kmoch M.², Loubová V.²

¹Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně; ² Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.

Úvod

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum a Pectobacterium atrosepticum jsou významné pektinolytické bakterie způsobující měkkou hnilobu hlíz bramboru a černání báze stonku bramboru. Jejich patogenita je založena zejména na produkci enzymů degradujících složky buněčné stěny, především pektinu.

Cílem práce bylo vyvinout metodu kvantifikace bakterií rodu Pectobacterium pro sledování jejich šíření v rostlinách, kořenech a půdě.

Materiál a metody

Předklíčené hlízy bramboru byly vysazeny do květináčů o průměru 19 cm, přičemž každá varianta zahrnovala 6 květináčů s jednou hlízou. Rostliny byly pěstovány ve venkovní zastřešené kóji od 4. 6. do 15. 7. 2025 a pravidelně zalévány. Bakterie Pectobacterium atrosepticum (kmen CPPB 83; CARC v.v.i., Praha-Ruzyně) a P. carotovorum subsp. carotovorum (kmen CPPB 56; CARC v.v.i., Praha-Ruzyně) byly kultivovány 48 h na King B mediu při jejich optimální teplotě pro růst.

Po dosažení průměrné výšky stonků 40 cm byly u každé varianty seříznuty v 6 květináčích 3 stonky, přičemž na každém zůstaly dva listy. Na řez bylo aplikováno 100 µl bakteriální suspenze o koncentraci 1,5 × 10⁸ CFU/ml (0,5 McF).

Šíření bakterií do kořenů a půdy bylo hodnoceno 20 dnů po inokulaci pomocí dvou metod qPCR. Z každého květináče byl odebrán inokulovaný stonek (5–8 cm), vzorek kořenů a půdy z bezprostředního okolí kořenů. Kořeny byly analyzovány bez povrchové sterilizace a po sterilizačním oplachu etanolem a destilovanou vodou. DNA ze stonků a kořenů byla izolována pomocí DNase Plant Mini Kit, z půdy pomocí InnuSPEED Soil DNA Kit. DNA byla standardizována na 10 ng/µl.

Pro každou inokulaci bylo připraveno 18 vzorků a 6 kontrolních vzorků půdy odebraných před výsadbou. Kvantifikace probíhala pomocí nově navržených primerů pro oblast 16S rDNA, metodami relativní (Pfaffl, 2001) a absolutní kvantifikace. Relativní kvantifikace byla normalizována na 10 ng DNA sterilního tabákového pletiva (Nicotiana tabacum L.). Absolutní kvantifikace využívala kalibrační řadu DNA z čisté kultury CPPB 56 s definovaným počtem bakterií.

Výsledky

Absolutní hodnoty vyjadřující množství specifické DNA odpovídající DNA z určitého počtu kolonií patogenních bakterií na 10 ng celkové DNA vzorků jsou uvedeny na obrázku 1.

Z grafu na obrázku 1 je zřejmé, že 20 dnů po inokulaci zůstávala nejvyšší koncentrace P. carotovorum subsp. carotovorum v inokulovaných stoncích. Pohybovala se řádově 10⁵ až 10⁶ kolonií na 10 ng izolované DNA. Ve vzorcích půdy se průkazně zvýšila koncentrace P. carotovorum subsp. carotovorum řádově z desítek na tisíce kolonií. V obou variantách vzorků kořenů byla zaznamenána koncentrace bakterií nižší než v půdě. Rozdíly však nebyly statisticky průkazné, vzhledem velké variabilitě množství bakterií v kořenech, zejména těch povrchově sterilizovaných.

Obr. 1 Množství P. carotovorum subsp. carotovorum v rostlinných pletivech a půdě po inokulaci stonků bramboru. Kořeny I. mechanicky očištěné, kořeny II. povrchově sterilizované, půda K kontrolní vzorek.

Relativní kvantifikace umožnila porovnat rozdíly v distribuci bakterií rodu P. carotovorum subsp. carotovorum a P. atrosepticum (viz obrázek 2). I když použité primery byly navrženy primárně komplementární k sekvencím (16S rDNA), nasedaly (i když s nižší účinností) i do sekvencí P. atrosepticum. PCR s P. carotovorum subsp. carotovorum probíhalo se 100 % účinností, zatímco P. atrosepticum s 82 % účinností. Použitá metoda výpočtu NRQ podle Pfaffl (2001) však vzájemné porovnání umožňuje, protože odlišné účinnosti reakcí zohledňuje. V obou variantách byla jako základní kontrola (absolutní 1) brána průměrná hodnota Cq kontrolní půdy. Z grafu na obrázku 2 je zřejmá odlišná distribuce bakterií P.carotovorum subsp. carotovorum a P. atrosepticum rostlinách a půdě. Zatímco bakterie P. carotovorum subsp. carotovorum zůstávaly průkazně na nejvyšší úrovni ve stoncích, bakterie P. atrosepticum vykazovaly vyšší úroveň v kořenech, i když rozdíly mezi průměrnými hodnotami infekce ve stoncích a kořenech nebyly statisticky průkazné. Část bakterií přešla po inokulaci i do půdy. Oproti vzorkům kontrolní neinokulované půdy bylo množství bakterií přibližně 10× vyšší. Ve vzorcích z půdy (půda I.) byly také pozorovány minimální rozdíly mezi oběma druhy bakterií. 

Obr. 2 Relativní množství P. carotovorum subsp. carotovorum a P. atrosepticum v rostlinných pletivech a půdě. Kořeny I. mechanicky očištěné, kořeny II. povrchově sterilizované, půda K kontrolní vzorek.

Poděkování

Tato práce byla vypracována se státní podporou Ministerstva zemědělství ČR v rámci projektu NAZV QL24010148 „Alternativní způsoby biologické ochrany bramboru za využití bioagens a látek přírodního původu“.