Vývoj sady SSR markerů pro genotypování hrušně obecné (Pyrus communis L.) v jedné reakci

Žďárská I., Čmejlová J.*

VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o., * jana.cmejlova@vsuo.cz 

Úvod

U hrušně obecné existuje více než 3000 odrůd, které se liší mnoha vlastnostmi, proto je jejich správná identifikace stěžejní ve všech fázích rostlinné produkce. Pro určování odrůd se tradičně používají tzv. DUS testy sledující fenotypické a fenologické znaky, závisí však na zkušenosti posuzovatele. Vysoce spolehlivým řešením pro ověření identity jsou molekulárně genetické metody, např. genotypizace SSR markery (Simple Sequence Repeats).

Pro potřeby genotypování hrušní bylo vyvinuto několik sad SSR markerů, z různých důvodů je však vhodné je modernizovat. Jako první byla vyvinuta sada v rámci evropského konsorcia ECPGR (The European Cooperative Programme for Plant Genetic Resources), která obsahovala 17 SSR markerů s dinukleotidovou repeticí. 12 SSR markerů bylo amplifikováno po 4 lokusech ve 3 multiplexech, zbylé byly analyzovány jednotlivě. Ačkoli měla tato sada vysokou heterozygotnost, byla náročná na provedení i vyhodnocení, rovněž cena za analýzu odrůdy byla vysoká. Proto bylo v modernizované ECPGR sadě zachováno pouze 12 SSR markerů amplifikovaných ve 3 multiplexech za cenu snížení rozlišovací schopnosti. Další genotypizační sada vznikla v rámci protokolu USPGR (Uniform Standards for the Protection of Plant Genetic Resources), ta využívá 10 SSR markerů, některé s delšími repeticemi, které jsou stabilnější a méně náchylné na nespecifity. Tyto markery však vykazovaly nižší heterozygotnost. Výhodou USPGR sady byla amplifikace v jediné multiplexní reakci.

Cíl

Cílem této práce byl vývoj nové sady SSR markerů, která by kombinovala výhody obou přístupů – měla by vysokou rozlišovací schopnost a zároveň by umožňovala identifikaci odrůd v jediné reakci.

Metody

Pro analýzy bylo využito 265 hrušní z genofondové sbírky VŠÚO. Celkově bylo testováno 67 SSR markerů, které byly nejprve in silico zamapovány do hrušňového genomu (většina SSR markerů byla vyvinuta u blízce příbuzné jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.). Podle zamýšlené délky amplifikovaného fragmentu byly navrženy primery, aby mohla ve finálním uspořádání probíhat analýza v jediné reakci s jasným přiřazením jednotlivých alel ke konkrétním SSR markerům. Nejprve proběhlo testování na 18 diploidních odrůdách, kdy byla fragmentační analýzou na genetickém analyzátoru testována účinnost PCR amplifikace. Byla vyhodnocena následující kritéria: (i) žádná nebo velmi neefektivní amplifikace; (ii) nízká heterogenita markeru; (iii) více než dva fragmenty; (iv) výskyt alel lišících se o méně než 1 nukleotid. Splnění jakéhokoliv z těchto kritérií vedlo k vyřazení SSR markeru.

Zbylé SSR markery byly analyzovány na dalších 48 odrůdách a výsledky byly statisticky zhodnoceny. Následně byly nejlepší markery vybrány pro sestavení multiplexní reakce, z každého ze 17 hrušňových chromozómů byl zařazen 1 marker. Primery byly značeny 6-FAM, VIC, NED nebo PET a jejich koncentrace byly upraveny tak, aby bylo dosaženo srovnatelných výšek signálu. Výsledná sada byla ověřena na celé genofondové sbírce a výsledky byly statisticky vyhodnoceny.

Výsledky

Finální sada pro genotypování hrušní zahrnuje 17 vysoce polymorfních SSR markerů analyzovatelných v jedné reakci (Obr. 1). Tato sada dosahuje vysoké průměrné heterozygotnosti (0,85) a mimořádně nízké pravděpodobnosti náhodné shody dvou genotypů (4,8×10^-24). Genotypizace v jedné PCR reakci výrazně snižuje náklady na analýzu, dobu potřebnou pro analýzu i možnou chybovost. Je vhodná jak pro vědecké účely (např. správa genofondových sbírek či ověřování rodičovských kombinací), tak i pro rutinní zemědělskou praxi (kontrola produkčního řetězce materiálu pro výsadbu sadů).

Poděkování

Výzkum byl realizován za podpory Národní agentury pro zemědělský výzkum Ministerstva zemědělství České republiky č. QK22010268.

Obrázek 1. Příklady výstupu z fragmentační analýzy 17 SSR markerů v jediné reakci pro diploidní odrůdu 'Konference' (A) a triploidní odrůdu 'Lucasova' (B).