Antifungální účinnost rostlinných extraktů

Žabka M, Militká T

Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu

Úvod a cíl

M. laxa představuje významného původce moniliové spály zejména u peckovin, a proto byla v této studii zvolena jako cílový modelový patogen pro hodnocení antifungální účinnosti rostlinných extraktů.

Potlačování houbových patogenů představuje významnou součást ochrany rostlin. V konvenčních systémech produkce je ochrana proti houbovým chorobám založena především na aplikaci syntetických fungicidů. Dostupnost a používání některých účinných látek je však stále více ovlivňována regulatorními a poměrně přísnými požadavky zaměřenými na omezení environmentální zátěže spojené s používáním přípravků na ochranu rostlin, zejména v rámci Evropské unie. Tato problematika nabývá na významu zejména v ekologickém zemědělství Současně mohou v některých případech představovat významný problém rezidua fungicidů s potenciálními přímými či nepřímými nežádoucími účinky na ekosystém. Z těchto důvodů se stále větší pozornost věnuje hledání alternativních prostředků s nižší environmentální zátěží. Jednou z možností jsou látky přírodního původu, zejména rostlinné extrakty. Jejich biologická aktivita může souviset s přirozeným obsahem sekundárních metabolitů. Chemická rozmanitost rostlinných metabolitů činí především ze skupiny léčivých a/nebo aromatických rostlin potenciálně významný zdroj. Cílem této práce bylo provést screening antifungálního potenciálu methanolových extraktů vybraných rostlinných druhů, jejichž vodní extrakty byly testovány v předchozí studii a jejichž schopnost významně inhibovat růst M. laxa byla prokázána. Studie probíhala formou měření inhibiční aktivity až do fáze finálních dose response křivek. Vybrané efektivní druhy s antifungální účinností vůči M. laxa, schopné potlačovat růst tohoto patogenu, zvažované jako složky potenciálních botanických preparátů, byly následně hodnoceny a diskutovány s ohledem na obsah biologicky aktivních látek.

Materiál a metody

Izolace determinace a uchovávání kultury M. laxa

Testovaný kmen M. laxa (Ml-2507MZ) byl izolován v roce 2025 pod mikroskopem z infikovaného mumifikovaného plodu třešně. Po dvoustupňovém přečištění (pomocí kultivace na ATB/Chloramphenicol) je kultura udržována v pracovní laboratorní sbírce v nativním stavu v termostatu při teplotě 18 °C a pravidelně pasážována na potato dextrose agar (PDA). Determinace druhu byla provedena na základě makro a mikro morfologických znaků pod mikroskopem a následně potvrzena na základě molekulárně genetických metod pomocí specifických ITS primerů a následné sekvenace ITS regionu rDNA.

Rostlinný materiál a jeho extrakce

Pro tuto studii byl použit rostlinný materiál ze tří významných a dostupných druhů s prokázanou biologickou antifungální aktivitou, a to Laurus nobilis (vavřín vznešený), Glycorhiza glabra (lékořice lysá)a Urtica dioica (kopřiva dvoudomá). Testované rostlinné druhy pro tuto studii byly vybrány na základě testů vodních extraktů a jejich výsledků zjištěných v předchozích studiích. Rostliny byly získán z vlastních zdrojů a od firmy Byliny Mikeš, s.r.o. Česká republika. Sušené specifikované části testovaných rostlinných druhů byly zhomogenizovány. Methanol v čistotě p.a. (per analysis) byl pořízen u firmy Sigma-Aldrich s.r.o (Merck). Cílové extrakty byly získány methanolovou extrakcí. Extrakce probíhala v kónických Erlenmayerových baňkách, v poměru sušená droga/methanol 1:4 (w/v) na třepačce (100 rpm) po dobu 72 hod. při teplotě 21 °C. Získané extrakty byly posléze zkoncentrovány odpařením methanolu na rotační vakuové odparce při teplotě ≤ 50 °C. Výtěžek byl vyjádřen v procentech vztažených k počáteční hmotnosti extrahovaného materiálu. Seznam vybraných rostlinných druhů a jejich vybraných částí (tzv. drogy) zvoleného pro testování antifungálního potenciálu je uveden v Tab. 1.

 Tab. 1: Vybrané rostlinné druhy, jejich části a výtěžek MeOH extraktu

Testování inhibičního efektu proti vybranému patogenu

Inhibiční vlastnosti testovaných rostlinných extraktů na myceliární růst patogenní houby M. laxa byly testovány pomocí diluční metody. Rostlinné extrakty získané MeOH extrakcí vybraných sušených a homogenizovaných vzorků byly důkladně rozpuštěny v bramboro dextrózovém agaru (PDA) při teplotě do 50 °C v přesně dané koncentrační řadě. Kultivace probíhala po dobu 10 dní v termostatu při teplotě 21 °C ve 4 opakováních. Hodnoty inhibice vyjádřené též ve tvaru dose response křivek jsou uvedeny v Grafu 1.

Výsledky

Výsledky potvrzují efektivní účinnost alkoholových (methanolových) extraktů všech třech vybraných rostlinných druhů (viz Graf 1.). Hodnoty inhibiční účinnosti od 50 % jsou považovány za efektivní. U všech třech testovaných druhů bylo prokázáno překlenutí efektivní hladiny inhibice (≥50 %) růstu cílového patogena M. laxa. V testovaném koncentračním gradientu dva ze tří vybraných druhů, a to G. glabra a L.nobilis v tomto experimentu prokázaly vysokou a pro vývoj potenciálních botanických preparátů slibnou hladinu efektivity dokonce 85-100 %. Extrakt U. dioica sice přesáhl hladinu 50% inhibice, ale až v koncentračním bodě 1 mg/mL. Navíc, díky menší strmosti dose-response křivky dosáhl maximální účinnosti nepřekračující 58 %. Rozdíly mezi extrakty souvisejí s koncentrací a povahou extrahovaných látek, především s jejich polaritou. Methanolová extrakce umožňuje získat jiné spektrum a koncentraci sekundárních metabolitů než například extrakce vodou.

Graf. 1: Dose response křivky a hodnoty inhibice M.laxa v gradientu testovaných extraktů